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Descrizione generale

Per terapia genica si intende la rimozione di un difetto genetico a livello di DNA, mediante l'introduzione in organismi o cellule umane di materiale genetico in grado di prevenire o curare una condizione patologica. I progressi nei settori della biologia e della genetica molecolare, in particolare la clonazione di numerosi geni, il riconoscimento che mutazioni a carico di questi sono spesso responsabili di malattia, la dimostrazione (già ottenuta negli anni Sessanta del secolo scorso) che le cellule di mammiferi sono in grado di internare ed esprimere molecole di DNA esogeno, hanno costituito le premesse razionali per questo approccio concettualmente rivoluzionario al trattamento delle malattie. generale la terapia genica trasmette istruzioni – sotto forma di una sequenza di DNA, detta transgene – a cellule malate in modo tale che queste producano una proteina o un acido nucleico funzionale (RNA antisenso) in grado di contrastare la patologia. Questo tipo di terapia è possibile per il fatto che virus, batteri, piante e animali condividono tutti lo stesso codice genetico: poiché i geni di una specie possono essere letti e compresi da un'altra, ora sappiamo che si possono trasferire geni fra cellule e specie. Inizialmente immaginata come una nuova forma di terapia delle malattie ereditarie, la terapia genica ha visto estendere i propri campi di applicazione anche a patologie acquisite (dai tumori alle malattie infettive) e ne è stato prospettato l'impiego anche allo scopo di prevenire stati di malattia. Nel caso delle malattie genetiche, in cui un gene è difettoso o assente, la terapia genica consiste essenzialmente nel trasferire la versione funzionante del gene nell'organismo dell'ospite, in modo da rimediare al difetto.

Cenni storici

Le prime esperienze di terapia genica risalgono agli anni Settanta-Ottanta del XX secolo. Nel 1970, negli Stati Uniti, alcuni pazienti affetti da argininemia (mancanza dell'enzimaarginasi), una rara malattia metabolica caratterizzata da grave ritardo neuromotorio, convulsioni e deficit nel linguaggio, furono infettati volontariamente con il Papillomavirus; la speranza era quella di beneficiare dell'enzima prodotto dal virus, ma restò tale. L'esperienza successiva fu ancora più ambiziosa. Verso la fine degli anni Settanta fu clonato il gene dell'emoglobina, le cui alterazioni sono responsabili di diverse malattie genetiche (dall'anemia falciforme a molte sindromi talassemiche). 1980 l'oncologo americano M. Cline tentò di trasferire il gene della beta-globina in cellule del midollo osseo di pazienti affetti da beta-talassemia major, una grave malattia genetica caratterizzata da anemia e sopravvivenza ridotta dai danni a carico di organi come il fegato, cuore, pancreas, ossa. Sebbene il gene fosse stato ritrovato nelle cellule del sangue periferico e nel midollo osseo per circa sei mesi, in realtà esso non era in grado di venire trascritto e tradotto in proteina, quindi non portò alcun miglioramento nei pazienti. Nell'insieme questi esperimenti erano legati a tecnologie insoddisfacenti per conseguire risultati terapeutici, ma aprivano la strada a indicazioni, modalità di impiego e rischi connessi con la terapia genica. Nel 1990 è stata applicata negli Stati Uniti (da W.F. Anderson, M. Blaese e K. Culver) la prima terapia genica sull'uomo, inserendo il gene responsabile dell'adenosina-deaminasi (ADA) nei linfociti T di una bambina di quattro anni sofferente di deficit di ADA. In teoria esistono due possibili tipi di terapia genica: terapia genica della linea germinale, capace cioè di influenzare la trasmissione del patrimonio genetico alle generazioni successive, e terapia genica della linea somatica, che invece interessa le cellule somatiche di un singolo individuo.

Terapia genica germinale

Con questo termine si intende la correzione di difetti genetici in cellule della linea germinale, ossia sui gameti, sulla cellula uovo fecondata e sulle cellule totipotenti; tale terapia prevede quindi l'ereditarietà delle modifiche genetiche attuate e per il momento essa risulta impraticabile e improponibile per un complesso di ragioni di natura tecnica, scientifica, sociale, ma soprattutto giuridica ed etica. Il principio etico fondamentale è quello dell'intoccabilità del patrimonio genetico dell'uomo, sancito e previsto ormai da diversi anni da varie normative internazionali: la dichiarazione di Helsinki del 1964 (e i suoi successivi emendamenti del 1975, 1983 e 1989), le “Direttive etiche internazionali per la ricerca biomedica condotta su soggetti umani” e le recenti disposizioni europee della Good Clinical Practice (linee guida dell'Unione Europea di buona pratica clinica). Va inoltre detto che da un punto di vista scientifico questa terapia non è ancora in grado di garantire né un normale sviluppo dell'individuo, né la completa eliminazione della patologia nella discendenza, e risulta impossibile anche prevederne eventuali conseguenze dannose.

Terapia genica somatica

Questo tipo di terapia consente la “guarigione” di isolate popolazioni cellulari. È possibile applicarla quando ci si trovi di fronte a una malattia determinata da un'alterazione ereditaria che si limiti a un singolo gene (mutazioni spesso puntiformi). Tali mutazioni devono essere recessive e presenti quindi in omozigosi per manifestarsi nella condizione patologica; dunque è sufficiente l'aggiunta di una sola copia della forma normale del gene per annullare l'effetto della mutazione. Il metodo generalmente utilizzato per effettuare la terapia genica somatica consiste nelle seguenti tre tappe: isolamento del gene, scelta delle cellule bersaglio, trasferimento del gene funzionante nelle cellule bersaglio. § Isolamento del gene. Un gene è una porzione di DNA che contiene le informazioni necessarie a fabbricare una proteina. Trasferire un gene significa quindi trasferire un pezzo particolare di DNA; prima però è necessario "avere in mano" il pezzo giusto. Le malattie genetiche conosciute sono circa 5000, ognuna causata da una diversa alterazione genetica. La prima tappa verso la terapia genica è quindi quella di identificare il gene responsabile della malattia; in seguito, tramite le tecniche di biologia molecolare, è possibile ottenere un pezzo di DNA che contiene il gene. Questa prima tappa si chiama isolamento o clonazione del gene. Nessuna malattia è candidata alla terapia genica fino a che non sia stato isolato il gene (o i geni) da trasferire. Grazie ai progressi della biologia molecolare e della genetica, questa prima tappa è oggi relativamente più semplice rispetto a qualche anno fa: è stato possibile isolare numerosi geni responsabili di malattie genetiche e altri se ne scoprono quasi ogni settimana. § Scelta delle cellule bersaglio. In secondo luogo è indispensabile stabilire con esattezza il bersaglio cellulare che si vuole raggiungere. Per esempio, se si intende curare una malattia genetica che dipende da un difetto funzionale a carico delle cellule del fegato (come l'ipercolesterolemia familiare, in cui è alterato il recettore per le lipoproteine a bassa densità che è normalmente espresso dagli epatociti), è necessario pensare di trasferire il gene di interesse direttamente nelle cellule del fegato e non in altre. Alcuni tipi di cellule sono più accessibili di altre e per questo si ipotizzano principalmente due procedure, in vivo o ex vivo. La procedura di terapia genica in vivo mira a trasferire il DNA direttamente nelle cellule o nei tessuti del paziente: se si intende una malattia del sistema nervoso centrale, del fegato o dei polmoni (o in ogni modo a carico di tessuti poco accessibili) è indispensabile ricorrere a strategie che facciano penetrare il gene direttamente nell'organismo del paziente, e più in particolare nel tessuto-bersaglio. Nelle procedure ex vivo, invece, il DNA viene dapprima trasferito in cellule isolate dall'organismo (fibroblasti della cute, linfociti, cellule del midollo osseo) e propagate in laboratorio, che in seguito possono essere introdotte nel paziente. Questa procedura indiretta, anche se più lunga, offre il vantaggio di una migliore efficienza di trasferimento e la possibilità di selezionare e amplificare le cellule modificate prima della reintroduzione. La selezione è di estrema importanza, perché in tal modo si eliminano le cellule danneggiate o addirittura quelle trasformate in cellule neoplastiche proprio dall'introduzione del gene. § Trasferimento del gene funzionante nelle cellule bersaglio. Che si tratti di procedure in vivo o ex vivo lo scopo è lo stesso: il gene deve essere trasferito all'interno delle cellule bersaglio e, una volta inserito, deve "resistere" per un tempo sufficiente. In questo tempo il gene deve poter produrre sufficienti quantità di proteina, rimediando così al difetto genetico. Si possono riassumere tutte queste caratteristiche in un solo concetto: il gene estraneo si deve "esprimere" in modo efficace nell'organismo ospite. Il sistema più semplice sarebbe naturalmente quello di iniettare direttamente il DNA (DNA "nudo") nelle cellule o nei tessuti da curare. Esperimenti condotti in questo senso hanno però dimostrato che l'efficienza con cui le cellule sono in grado di captare molecole di DNA nudo è molto bassa ed esso viene inoltre degradato prima di raggiungere il nucleo. Per questo motivo sono stati disegnati appositi sistemi di iniezione sotto getto pressurizzato: un gene-gun. In questo sistema molecole di DNA legate a particelle d'oro vengono sparate da un propulsore a elio con pressione tale da poter attraversare diversi strati cellulari e penetrare fino ai nuclei delle cellule bersaglio; tuttavia, il metodo non è ad alta efficienza e il transgene viene espresso solo per un periodo di tempo transitorio, poiché il DNA non si integra nel genoma dell'ospite.

Terapia genica somatica: i vettori virali

Il veicolo più efficace per inserire una porzione di DNA all'interno di una o più cellule bersaglio è sicuramente rappresentato dai virus. Queste particelle sono, infatti, naturalmente in grado di penetrare all'interno delle cellule e di far funzionare il loro patrimonio genetico, “dirottando” la trascrizione e la traduzione del materiale genetico cellulare verso il proprio. le tecniche di ingegneria genetica è possibile aggiungere al DNA del virus il gene che si vuole trasferire: il materiale genetico virale viene modificato dall'inserimento del gene che si vuole introdurre nelle cellule bersaglio e privato invece dei geni che ne determinano la virulenza. Il virus, infettando la cellula bersaglio, porterà con sé una o più copie del gene desiderato ma non arrecherà danni; inoltre, per evitare una propagazione incontrollata del virus nelle cellule dell'organismo ricevente, il materiale genetico virale viene anche privato della capacità di replicarsi. Tale costrutto viene definito come replicazione-deficiente (o incompetente). I retrovirus hanno per loro natura la capacità di integrare il loro DNA all'interno dei cromosomi delle cellule bersaglio; quindi, il gene verrà inserito stabilmente nei cromosomi della cellula infettata e potrà essere trasmesso a tutte le cellule figlie. I retrovirus infettano solo cellule che stanno proliferando. I metodi che prevedono l'integrazione stabile del gene nei cromosomi della cellula bersaglio comportano rischi di trasformazione neoplastica. I virus adenoassociati integrano anch'essi il loro DNA nei cromosomi della cellula ospite; hanno il vantaggio di essere per natura innocui rispetto ai retrovirus, ma difficilmente trasportano geni di grandi dimensioni. Gli adenovirus non si integrano nei cromosomi della cellula ospite; possono trasportare geni di grosse dimensioni, ma la loro espressione non dura nel tempo. § Sperimentazione dei vettori virali. I sistemi virali di trasferimento non hanno risolto tutti i problemi. Effettivamente sono in grado di trasferire con buona efficienza il gene di interesse, sfruttando le proprietà biologiche dei virus che da milioni di anni hanno imparato a infettare le cellule di mammifero, e quindi anche dell'uomo. Contemporaneamente, però, l'equilibrio biologico imposto dall'evoluzione ha fatto sì che l'ospite abbia sviluppato idonei sistemi di difesa nei confronti delle infezioni virali: l'attività del sistema immunitario rappresenta uno dei principali problemi dei sistemi di trasferimento genico. Bisogna infine ricordare che ogni vettore ha proprie caratteristiche che lo rendono adatto a trasferire mediante infezione alcune categorie di cellule. Per esempio, i retrovirus, che per loro natura si integrano stabilmente nel genoma delle cellule ospiti, sono particolarmente adatti per le cellule che si dividono; gli HSV (Herpes Simplex Virus) per le caratteristiche neurotrope risultano indicati per le cellule del sistema nervoso centrale; gli adenovirus sono impiegati per quelle dell'epitelio polmonare e per quelle gliali; per altre cellule che non si dividono, come quelle muscolari, è stata impiegata l'iniezione diretta di DNA in vivo, attraverso liposomi. Fra le principali malattie sulle quali si sta sperimentando la terapia genica somatica ricordiamo: ) la SCID (Severe Combined Immuno-Deficiency), una grave immunodeficienza congenita provocata dalla mancanza di sostanze che controllano il sistema immunologico, come l'ADA. La terapia genica è stata condotta su una quindicina di pazienti, negli Stati Uniti e in Italia (da C. Bordignon e A. Ugazio), utilizzando come vettore un retrovirus ingegnerizzato, il DCA (Double-Copy ADA) inserito nei linfociti T e nelle cellule staminali del sangue, che sono i precursori dei linfociti, con l'obiettivo di mantenere stabile l'espressione del gene, dato che i linfociti T hanno una vita limitata. Interventi simili sono stati compiuti anche a Parigi (da A. Fischer). ) La fibrosi cistica. Le terapie geniche, realizzate negli Stati Uniti (da R. Crystal e M. Welsh), hanno utilizzato come vettore un adenovirus, introdotto nell'organismo attraverso inalazione di aerosol e tramite catetere inserito nel lobo inferiore del polmone sinistro. Il vettore è stato messo a punto in collaborazione con ricercatori francesi (M. Perricaudet, I gliomi e altri tumori cerebrali). Sono in corso due linee di ricerca basate sui vettori erpetici e adenovirali. Quella con HSV (Anderson, Blaese e Culver negli USA) è detta anche dei “geni suicidi”, con un vettore basato su HSV-1 e in particolare sul gene del virus che codifica per la timidina-chinasi (TK), un enzima che sotto l'effetto di farmaci antivirali (aciclovir, ganciclovir) diviene citotossico. La strategia terapeutica è rivolta a transfettare con un HSV ingegnerizzato le uniche cellule del sistema nervoso centrale che si dividono, e cioè quelle tumorali; successivamente la somministrazione di farmaci antivirali dovrebbe permettere di distruggere selettivamente solo queste ultime, che esprimono il gene dell'HSV. La linea basata sugli adenovirus (M. Perricaudet), pur utilizzando un vettore che non ha come bersaglio naturale le cellule del sistema nervoso centrale, ma quelle epiteliali dell'apparato respiratorio, è riuscita ugualmente a transfettare cellule nervose. 'adenovirus è chiamato Ad.RSV-beta-gal, ed esprime l'enzima beta-galattosidasi sotto il controllo della sequenza regolatrice virale del RSV (il virus del Sarcoma di Rous). La sperimentazione ha mostrato che l'adenovirus ingegnerizzato è riuscito a esprimere la beta-galattosidasi in neuroni e astrociti in coltura e, in vivo, nelle cellule dell'ippocampo di ratti attraverso inoculazione stereotassica. ) I linfomi. La tecnica dei “geni suicidi” è stata impiegata anche in Italia (C. Bordignon) per la prima immunoterapia genica di un linfoma causato dall'EBV (virus di Epstein-Barr). ) I melanomi. Il vettore retrovirale con il gene dell'HSV-1 che produce l'enzima TK è al centro anche della terapia genica per i melanomi sperimentata in Francia (D. Klatzmann). In USA è stato invece sperimentato un protocollo basato sull'iniezione diretta di DNA contenuto in liposomi (G. Nabel). Tale metodo si basa sulla constatazione che i geni esogeni riescono ad attraversare la membrana plasmatica delle cellule e, pur non integrandosi nel genoma cellulare, riescono ugualmente a funzionare per un certo periodo di tempo. Sono in atto sperimentazioni di terapie geniche come quella basata sull'inserimento del gene TK in linfociti torrente Successivamente viene somministrato un farmaco antivirale (aciclovir) per eliminare selettivamente i linfociti infettati col virus HIV. Un'altra ricerca è quella basata sul prelievo di linfociti CD-4, nei quali viene poi inserito un gene in grado di determinare la rottura dell'RNA virale, bloccando la capacità del virus HIV di entrare nei CD-4 e riprodursi. I linfociti vengono fatti crescere in coltura fino a raggiungere ciascuno dieci miliardi di unità e poi sono ritrasfusi nei pazienti. ) L'ipercolesterolemia ereditaria. È stata attuata anche una terapia genica contro questa disfuzione (J. Wilson negli USA). La tendenza generale è di reinserire il gene che codifica il recettore del colesterolo LDL negli epatociti del paziente privo di questo gene con un vettore virale.

Prospettive della terapia genica

La dimostrazione che è possibile inserire materiale genetico esogeno in cellule di mammifero per ottenere la produzione di proteine ha generato grandi aspettative nei confronti della terapia genica, molte delle quali si sono però rivelate illusorie. All'inizio degli anni Novanta del XX secolo la comunità scientifica prevedeva che nell'arco di due o tre anni la terapia genica avrebbe sostituito in massima parte quella tradizionale. Nel 1995 la commissione americana preposta al controllo notò che il rischio più grave di questa eccessiva fiducia stava nel fatto che in nome dell'innovazione venivano abbandonate terapie tradizionali la cui efficacia era limitata ma comunque dimostrata. conoscono circa 5000 anomalie riconducibili a disfunzioni geniche, molte delle quali sono causate dalla disfunzione di un singolo gene e per le quali non esiste un trattamento realmente efficace. Vi sono però delle eccezioni. Nel caso dei tumori del sangue, per esempio, si è scoperto che è la cellula staminaleematopoietica quella su cui è necessario agire, in quanto è la cellula madre di tutte le altre e solo successivamente si differenzia in globulo rosso, linfocita e così via. Nel 1999 un gruppo di ricerca italiano coordinato da Cesare Peschle, direttore del Dipartimento di ematologia e oncologia dell'Istituto superiore di sanità, è riuscito a definire questa cellula primitiva a livello molecolare nei tessuti adulti. Gli emoangioblasti, così sono stati denominati, sono in grado di differenziarsi per formare sia le cellule ematiche sia quelle epiteliali di vene e arterie. In via teorica sarebbe quindi possibile la produzione in vitro di grandi quantità di queste cellule staminali da trapiantare per “rimettere a nuovo” vasi sanguigni danneggiati. Non solo, una scoperta di questo tipo potrebbe rappresentare una soluzione per il lungo dibattito etico che avvolge la ricerca sulle staminali embrionali. L'identificazione di staminali pluripotenti nei tessuti adulti alimenta le speranze di trovare in futuro delle cellule staminali totipotenti, proprio come quelle embrionali. In questo modo sarebbe possibile continuare la ricerca su tutti i tipi di staminali, senza dover ricorrere agli embrioni, il cui uso è osteggiato soprattutto dal mondo cattolico, che considera l'embrione come un essere umano. Come si può vedere, la terapia genica umana continua a costituire in ogni caso la prospettiva più promettente e socialmente rilevante del Progetto Genoma Umano.

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